精子冻存损伤的修复是一个热门话题，在辅助生殖技术（assisted reproductive technology，ART）中起着重要的临床指导意义。精子冻存损伤的DNA在受精后得到修复，主要由受精卵行使其修复功能，有研究显示DNA损伤精子在原核发育期得到修复，受精卵中的γH2AX、53BP1信号分子与DNA损伤修复有密切关系。DNA损伤精子修复主要是通过同源重组修复与非同源的末端连接共同行使修复功能。可能涉及下列修复机制：
一. 冷冻精子氧化应激性DNA损伤
据研究，人及动物精子在冻存后均存在DNA断裂的现象1,2。研究证实：冷冻可刺激精液产生过量的活性氧类物质（reactive oxygen specials，ROS），损伤精子的结构与功能3。当ROS过量产生，消耗了精液（浆）的抗氧化防御体系，则会出现氧化应激状态, 冷冻损伤中氧化应激是一个很重要的因素。ROS可通过直接氧化精子DNA碱基，或者通过其脂质过氧化物MDA（丙二醛）与DNA共价结合，引起DNA链断裂，最后导致子代异常4。高水平ROS与频发的DNA链断裂有关，ROS 能导致单或双链DNA断裂5。将精子暴露于人工产生的ROS引起DNA损伤包括碱基修饰，碱基位点缺失、移码、DNA交联以及染色体重排6。总之，冷冻精子会引起精子DNA链断裂损伤。
二. DNA损伤精子在受精后的修复
在真核细胞中,识别和修复DNA损伤已广为人之7。在精子发生、形成和变形的过程中，DNA损伤与修复系统机能随之丢失。精子DNA损伤须在受精后得到修复,才能保证可靠的遗传信息传递到胚胎中。因此对精子DNA损伤后修复的研究有重要临床指导意义。文献报道：与暴露于致突变物质的精子受精后，卵子具有基础的DNA修复能力8。对卵胞浆内mRNA的分析为大量修复基因存在于胚胎早期发展阶段提供了证据9。哺乳类动物受精卵中如何执行对DNA损伤应答反应的相关机制如下：
三. 同源重组修复与非同源的末端连接在受精卵细胞周期中的作用
非同源末端连接(nonhomologous end joining, NHEJ )及同源重组修复(homologous recombination repair，HRR)是DNA链断裂的重要修复途径10，但是此修复途径是否与DNA损伤精子受精后修复机制有关呢？有研究提示：NHEJ和HRR在受精卵细胞周期中共同起作用，小鼠精子DNA损伤受精后的受精卵中涉及NHEJ及HRR。大多数的DNA修复蛋白好像只是通过NHEJ 或HRR起作用，但是很多蛋白同时影响这两个通路，包括：MRE11（meiotic recombination 11 homolog A）/RAD50/NBS1 （Nijmegen breakage syndrome 1 ）(XRS2) 复合物, BRCAA （Breast Cancer Gene 1）, 组蛋白 H2AX, PARP-1（ poly(ADP-ribose)polymerase-1聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶-1）, RAD18, DNA-PKcs（DNA Dependant Protein Kinase Catalytic subunit， DNA依赖的蛋白激酶催化亚基）和 ATM（ataxia telangiectasia mutated，运动失调性毛细血管扩张症突变体)10。研究者通过RAD51，DNA-PKcs信号标记提出G1期（PN1到PN2期）主要通过NHEJ修复；在S期主要通过HRR修复，同时也伴有NHEJ修复现象存在11。HRR的起始:在ATM介导的H2AX磷酸化之后,活化的ATM与DSB DNA结合,进而磷酸化结合至γH2AX焦点的53BP1, BRCA1也结合至损伤位点的53BP1。参与HRR调控的重要分子：RAD51，ATM、ATR(ataxia-telangiectasia and Rad3-related)、p53等。HRR通路被激活时, 细胞内能检测到明显的RAD51灶 (RAD51 foci) ,被认为是RAD51激活的表现。ATM功能缺失的细胞在发生DNA损伤时不能及时形成RAD51灶。复制依赖的DNA链断裂主要激活ATR，后者通过磷酸化CHK1调控RAD51的激活进而影响HRR修复系统的效率。PI-3K家族激酶 (ATM, ATR)能够催化H2AX发生磷酸化，并且募集DNA损伤修复蛋白12,13。电离辐射诱导的H2AX的磷酸化主要由ATM和DNA-PKcs负责,实验表明两者在功能上有一定的重叠,因为在只缺失ATM或DNA-PKcs的情况下,H2AX的磷酸化水平相似,而如果两者同时缺失,则H2AX的磷酸化完全消失14,15。在DNA复制受到抑制的细胞中,ATR是使H2AX磷酸化的主要激酶16 ,17，DNA-PKcs也具有一定的作用18。DNA双链断裂后， ATM和DNA-PKcs蛋白激酶被激活，证据表明，经紫外线照射后这些激酶迅速被ATR激酶磷酸化19。ATM、ATR是HRR调控的重要分子，已有大量证据表明,DNA-PKcs的激酶活性是NHEJ修复所必须的。最近的研究表明H2AX、ATM、53BP1参与了NHEJ 修复通路，提示两种修复通路都涉及到了γH2AX及53BP1，说明γH2AX、53BP1分子与 DNA损伤精子受精后修复可能有关。
四. 受精卵中上述修复通路中γH2AX、53BP1信号分子与DNA损伤精子修复的关系
有研究显示胚胎带有父系传播的染色体畸变的风险取决于母系在受精后第一个周期的DNA修复效力，结果表明，父系接触电离放射线后，小鼠母系DNA修复途径遗传性的破坏显著增加了受精卵染色体结构畸变的频率20。由于雄鼠DNA损伤精子在受精后G1期（PN1到PN 2期）主要通过NHEJ修复，提示DNA损伤精子在原核发育期得到修复。γH2AX在受精卵DNA损伤修复中起着重要的生理作用。H2AX的翻译后修饰在对辐射损伤的反应中发挥重要的作用，包括修复DSBs21 。DNA损伤的精子进入卵母细胞以后，雄染色质开始形成原核，在重构的雄染色质中，发现卵母细胞中γH2AX焦点明显增加。在含有环磷酰胺处理的父系精子的受精卵中，γH2AX呈两个阶段增高，每一阶段相应于受精卵第一个细胞周期的重要的调整阶段。γH2AX呈现最初的亮点发生在正在进行重组的雄原核的核蛋白改变过程中。组蛋白和鱼精蛋白交换是磷酸化敏感的过程，这强调了γH2AX在早期雄原核染色体重组和DNA损伤修复中起着双重作用22。我们通过对体细胞研究时曾经发现，多种类型的遗传毒物能诱导γH2AX焦点形成，随着时间延长，焦点数量及强度下降，提示部分DNA损伤得到了修复23:少数情况下伴随着γH2AX焦点完全消失，示细胞DNA损伤己近彻底修复24。另有研究显示发育延迟或被阻断的DNA损伤精子受精后的受精卵PN期有大量的H2AX, Rad51 和Brca1焦点11，这也提示有修复的存在。γH2AX以及PI-3K的激活被认为是启动DNA损伤修复的关键。DNA链断裂可以诱导产生γH2AX,并且γH2AX的量和DNA链断裂的量存在正相关关系。也有研究显示：γH2AX随后募集大量的必需修复蛋白到DNA损伤部位形成γH2AX焦点复合物，共同参与DNA损伤修复25，26。通过特异抗体检测发现，在γH2AX位点有DNA修复蛋白53BP1，它有一个生物学功能，就是修复受损的DNA链。研究表明γH2AX对维持53BP1在DNA链断裂位点聚集是必须的27。H2AX锚定在染色质上并标记断裂位点,移动因子如53BP1 由于与γH2AX的C末端尾部有亲和力或染色质变构聚集到断裂位点28。研究显示在DNA损伤后, 53BP1可以快速作用于损伤的DNA ,这个蛋白包括大量Ser/Thr/Gln位点,体外可以被ATM磷酸化,53BP1的功能还不清楚,但推 测其与DNA 损伤诱导的关卡有密切关系29。γH2AX并不构成DNA链断裂修复蛋白重分布于损伤染色质的初始信号，但对断裂DNA附近的浓集蛋白起作用。修复因子在双链损伤部位的聚集、装配和稳定依赖γH2AX 27。目前,γH2AX的水平已经成为公认的DNA链断裂发生早期的标志,为DNA损伤和修复的研究提供了比较理想的指标。有研究显示：小鼠精子经过DNA损害物质处理后，雌雄染色质在受精卵PN期的大γH2AX焦点比雄染色质浓缩期有所减少30。Barton等在研究环磷酰胺致DNA损伤精子受精后修复的研究中，观察到原核（PN）1期形成的γH2AX焦点于PN2期（PN1到2期相当于G1期）有所减少22，提示修复的存在，故DNA损伤精子在受精卵的原核发育期得到修复，可能涉及γH2AX/53BP1信号分子。后来有学者研究辐射诱导的53BP1/γH2AX焦点形成的动力学及这些焦点共区域化、DSB 修复及细胞存活之间的关系，他们提出直接比较53BP1/γH2AX动力学及53BP1/γH2AX焦点共区域化是不可能的，应小心应用计数这些焦点来解释DSB 修复31。总之，γH2AX、53BP1信号分子在NHEJ和
HRR修复通路中起着重要的作用。
五.总结
总之，具体的精子DNA损伤在受精卵中的修复机制还有待进一步研究。DNA损伤，在男性生殖已经与精液质量差、受精率低、着床前发育异常、流产率增加和后代发病率提高等问题有关。DNA损伤在受精卵中的修复很大程度上解释了辅助生殖技术中精子冷冻DNA损伤可能导致的一些安全问题，并为临床工作作出理论指导。